PCR에 관하여 보고서
PCR에 관하여
중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 관한 자료입니다. PCR에대하여
☞ PCR
PCR은 polymerase chain reaction의 약자로 한글로 풀어 얘기하자면 중합 효소 연쇄 반응이라 할 수 있겠다. DNA의 양쪽 가닥을 주형으로 DNA를 선택적으로 증폭시키는 방법으로 DNA 복제에 있어서 꼭 필요한 방법이다.
일반적으로 PCR 과정은 크게 Predenaturation후 DNA denaturation, primer의 annealing, extension 의 세과정을 반복한 다음 end filling 을 거쳐 4℃에서 보존하게 된다.
1. Predenaturation : 94℃에서 3분간 진행.
2. DNA denaturation : 94℃에서 15초에서 1분간을 표준으로 하지만 30초로도 충분. 너무 길면 DNA polymerase에 이상이 생길 수 있음.
3. Primer Annealing : 제작한 primer에 따라 다름. primer을 제작하는 프로그램이나, 제작해 주는 회사에서 Tm값을 알려줌. 주로 55℃에서 60℃사이로 만들어지며 통상 30초에서 1분을 사용함.
4. Extension : 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로 Taq polymerase를 사용할 경우 72℃에서 1kb이하는 1분, 그 보다 긴 경우는 1kb당 1분의 비율로 길게 설정. 즉, template가 3kb인 경우 3분으로 하겠죠..
5. 2번부터 4번과정을 25회에서 30회가량 반복.
6. End filling : 주형 DNA의 3`쪽의 충분한 Extension을 위해 72℃에서 10분간 실시.
8. 4℃에서 보관.
여기서 중요한 세 단계는 DNA denaturation, Annealing, Extension이다.
-Denaturation
DNA의 당인산 연결은 인산 에스테르 결합이라는 공유 결합으로 이루어져 있어 염기간의 결합인 하이드로젠 결합보다 강한 힘으로 결합이 되어 있다. 그러므로 적절한 열에 의해서 이중 가닥이 단일 가닥으로 변성될 때 각 단일 가닥들은 손상 없이 두 가닥으로 풀어진다. PCR에서 보통 90oC까지 열을 가하면 단일 가닥으로 풀어진다. 이 변성이 일어날 수 있는 것은 두 가지 이유인데, 첫 번째는 DNA의 양 말단은 항상 물에 노출이 되어 있고 물 분자는 각 염기와 수소결합을 할 수 있기 때문에 온도가 올라가면 이중 가닥의 끝이 풀어지게 되는 것이다. 그리고 두번째는 염기쌍이 물 분자와의 수소결합에 의해 끊어진 버블이 이중 헬릭스의 내부를 움직이고 있는 것 때문에 일어나게 된다. 주의할 점은 변성 온도가 너무 낮으면 떨어졌던 가닥들이 다시 붙을 수도 있으므로 적절한 온도를 지켜야 한다.
-Annealing
PCR의 최종적인 sensitivity와 specificity를 결정하는 제일 중요한 과정이다. Primer는 templates 같은 긴 DNA와는 달리 보통 15 bps이상 30bps이하의 oligonucleotide를 사용하는데 이런 짧은 DNA의 hybridization temperature를 결정하는 데에는 length, GC content, pH, salt concentration등 여러 요소가 영향을 미친다. 이 과정에서 primer가 biding하여 free 3’ end를 제공하면 여기서 polymerase가 chain extension을 시작한다. 실제로는 PCR에 사용하는 Taq polymerase의 활성 온도 이상의 annealing temperature를 가지는 primer는 사용할 수 없다.
-Extension
Taq 중합효소가 primer의 3’end의 free OH기를 시작점으로 해서 단일 가닥 template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여 나가며 체인 확장을 시행한다. 처음 cycle에서는 template를 기준으로 합성이 되므로 target sequence와는 상관없이 3’방향으로 60 bps/sec의 속도로 계속 합성이 되어 나간다. 이론적으로는 template의 5` end까지 합성이 되어 나갈 수 있지만 extension time이 무한대가 아니므로 다음 cycle의 denaturation step까지 합성이 된다. 보통 500bps 이하의 size는 20초면 충분한 extension이 되는 것으로 알려져 있다.
결국 한 사이클마다 두 종류가 생성이 된다. 한 종류는 original templates에 primer가 결합해서 생성이 되는 긴 생성물이고 또 한 종류는 긴 생성물과 표적 생성물을 templates로 primer가 결합하게 될 경우 생성이 되는 표적 생성물이다. long products의 경우는 매 cycle마다 1개씩 생성이 되므로 생성된 각 products의 비율을 계산해 보면 다음과 같다.
L (number of long products) = N (number of initial templates) x C (number of cycles)
target products의 경우는 매 cycle 마다 target products와 long products의 갯수만큼 새로이 생성이 된다.
이 PCR은 암과 관련된 Virus나 Pathogen의 검출, Human Genome Project에서 염기 서열 분석이나 유전자 지도를 만드는 Human Genetics, 멸종된 과거생물의 유전적 구성을 분석하는 Evolutionary Biology, 친자 감별이나 법의학적 용도인 Genetic Fingerprinting등에 응용되고 있다.
자료출처 : http://www.ALLReport.co.kr/search/detail.asp?pk=16164059&sid=qjfRnf777&key=
[문서정보]
문서분량 : 15 Page
파일종류 : HWP 파일
자료제목 :
파일이름 : PCR에 관하여.hwp
키워드 : PCR에,관하여
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